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Dec 11, 2023

La película

Volumen de comunicaciones de la naturaleza

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 4902 (2022) Citar este artículo

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Un sistema lab-on-a-chip con capacidad de prueba en el punto de atención ofrece un potencial de diagnóstico rápido y preciso y es útil en entornos con recursos limitados donde el equipo biomédico y los profesionales calificados no están fácilmente disponibles. Sin embargo, un sistema de pruebas en el punto de atención que posea simultáneamente todas las características requeridas de dispensación multifuncional, liberación bajo demanda, operaciones robustas y capacidad para el almacenamiento de reactivos a largo plazo sigue siendo un gran desafío. Aquí, describimos una tecnología de interruptor accionado por palanca de película que puede manipular líquidos en cualquier dirección, proporcionar una respuesta de liberación precisa y proporcional a la presión neumática aplicada, así como mantener la robustez durante movimientos bruscos y vibraciones. Con base en la tecnología, también describimos el desarrollo de un sistema de reacción en cadena de la polimerasa que integra las funciones de introducción, mezcla y reacción de reactivos, todo en un solo proceso, que logra un rendimiento de "muestra entrante, respuesta saliente" para todas las muestras clínicas nasales de 18 pacientes con Influenza y 18 controles individuales, en buena concordancia de intensidad de fluorescencia con reacción en cadena de polimerasa estándar (coeficientes de Pearson > 0,9). La plataforma propuesta promete una sólida automatización del análisis biomédico y, por lo tanto, puede acelerar la comercialización de una variedad de dispositivos de prueba en el punto de atención.

Las enfermedades humanas emergentes, como la pandemia de COVID-19 de 2020 que ha provocado la pérdida de millones de vidas, son una gran amenaza para la salud mundial y la civilización humana1. La detección temprana, rápida y precisa de enfermedades es fundamental para controlar la propagación de un virus y lograr mejores resultados en el tratamiento. Los ecosistemas de diagnóstico convencionales basados ​​en laboratorios centralizados, donde las muestras de prueba se envían a hospitales o clínicas de diagnóstico y son operados por personal profesional, actualmente limitan el acceso a cerca de 5.800 millones de personas en todo el mundo, en particular aquellas que viven en entornos de bajos recursos que carecen de costosos equipos biomédicos. y médicos calificados2. Por lo tanto, es muy deseable el desarrollo de un sistema lab-on-a-chip de bajo costo y fácil de usar con capacidad de prueba en el punto de atención (POCT) que brinde a los médicos información de diagnóstico oportuna para tomar decisiones informadas con respecto al diagnóstico y el tratamiento3.

Las directrices de la Organización Mundial de la Salud (OMS) establecen que una POCT ideal debe ser asequible, fácil de usar (fácil de usar con una formación mínima), precisa (evitar resultados falsos negativos o falsos positivos), rápida y robusta (garantiza una buena reproducibilidad) , y entregable (capaz de almacenamiento a largo plazo y fácil de obtener por los usuarios finales)4. Para cumplir con estos requisitos, los sistemas POCT deben ofrecer las siguientes características: dispensación multifuncional para disminuir la intervención manual, liberación bajo demanda para controlar proporcionalmente el transporte de reactivos para obtener resultados de prueba precisos y operaciones sólidas para resistir las vibraciones del entorno. Los dispositivos POCT más utilizados en la actualidad son las tiras de flujo lateral5,6 que consisten en varias capas de membranas de nitrocelulosa porosa que impulsan hacia adelante cantidades muy pequeñas de muestra, mientras reaccionan con los reactivos preinmovilizados a través de una fuerza capilar. Aunque son de bajo costo, fáciles de usar y ofrecen las ventajas de resultados rápidos, los dispositivos POCT basados ​​en tiras de flujo solo se pueden aplicar a bioensayos (p. ej., prueba de nivel de glucosa7,8 y prueba de embarazo9,10) sin requerir reacciones de varios pasos (p. ej., carga de múltiples reactivos, mezcla, reacción multiplexada). Además, la fuerza impulsora para controlar el movimiento del fluido (es decir, la fuerza capilar) no ofrece una buena coherencia, especialmente entre diferentes lotes, lo que resulta en una mala reproducibilidad11 y hace que las tiras de flujo lateral sean útiles principalmente para detecciones cualitativas12,13.

Las capacidades avanzadas de fabricación a micro y nanoescala han creado oportunidades para desarrollar dispositivos POCT basados ​​en microfluidos para mediciones cuantitativas14,15,16,17. Al ajustar las propiedades interfaciales18,19 y la geometría de los canales20,21,22, se puede controlar la fuerza capilar y el caudal de estos dispositivos. Sin embargo, su robustez, especialmente para líquidos altamente humectantes, todavía no es aceptable debido a la inexactitud de su fabricación, las imperfecciones del material y la susceptibilidad a las vibraciones ambientales23. Además, dado que el flujo capilar se genera en la interfaz líquido-aire, no se pueden introducir flujos adicionales, particularmente después de que los canales de microfluidos se llenen de líquido. Como resultado, se deben realizar varios pasos de introducción de muestras para lograr un ensayo más complejo24,25.

Entre los dispositivos microfluídicos, el dispositivo microfluídico centrífugo representa actualmente una de las mejores soluciones POCT26,27. Su mecanismo de accionamiento es ventajoso, es decir, ajustando la frecuencia de rotación se pueden controlar las fuerzas de accionamiento. Sin embargo, el inconveniente es que la fuerza centrífuga siempre se dirige al borde exterior del dispositivo, lo que crea dificultades para lograr reacciones de varios pasos que son necesarias para ensayos más complejos. Aunque se introducen fuerzas de actuación adicionales (p. ej., capilar28,29 entre muchas otras30,31,32,33,34,35) además de la fuerza centrífuga para lograr la dispensación multifuncional, aún puede ocurrir un transporte de líquido no intencional ya que estas fuerzas adicionales son en su mayoría órdenes de magnitudes más bajas que las fuerzas centrífugas, lo que las hace solo efectivas en rangos operativos pequeños, o incapaces de usar la liberación de líquidos a pedido. La combinación de operaciones neumáticas en microfluídica centrífuga, por ejemplo, el método centrífugo-dinámico36,37,38, el método termo-neumático39 y el método neumático activo40, han demostrado ser una alternativa atractiva. En el método contrifugo-dinámico, se integran en el dispositivo una cavidad adicional y microcanales de conexión para permitir manipulaciones tanto hacia el exterior como hacia el interior, aunque su eficiencia de bombeo (que oscila entre el 75 y el 90 %) depende en gran medida del número de ciclos de bombeo, así como de la viscosidad. de los fluidos En el método termoneumático, se diseñaron especialmente una membrana de látex y una cámara de transición líquida para sellar o reabrir una entrada cuando se calienta o enfría un volumen de aire atrapado. Sin embargo, la configuración de calefacción/refrigeración provoca un problema de actuación lenta y restringe su uso en ensayos sensibles al calor (p. ej., amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)). En el método neumático activo, la liberación de fluido bajo demanda y la manipulación interna se logran al aplicar simultáneamente presión positiva y una velocidad de rotación ajustada con precisión, habilitada por un motor de alta velocidad. Ha habido otros métodos exitosos que emplean solo mecanismos de accionamiento neumáticos (presión positiva41,42 o negativa43) y una estructura de válvula normalmente cerrada. Al aplicar presión secuencialmente en la cámara neumática, el líquido se bombea hacia adelante de forma peristáltica, por lo que la válvula normalmente cerrada evita que el líquido fluya hacia atrás, lo que permite manipulaciones de fluidos complejas. Sin embargo, actualmente solo existen tecnologías microfluídicas limitadas que pueden realizar un manejo de fluidos complejo en un solo dispositivo POCT, que incluye dispensación multifuncional, liberación bajo demanda, operación robusta, almacenamiento a largo plazo, manejo de líquidos de alta viscosidad y fabricación rentable. -todo al mismo tiempo. La falta de funcionamiento de la funcionalidad de varios pasos también podría ser una de las razones por las que solo unos pocos productos POCT comerciales (por ejemplo, Cepheid, Binx, Visby, Cobas Liat y Rhonda) hasta la fecha se han adoptado con éxito en el mercado abierto.

En este documento, presentamos un tipo de mecanismo de accionamiento microfluídico neumático basado en una tecnología de interruptor accionado por palanca de película (FAST). FAST incorpora simultáneamente todas las características necesarias y es capaz de manejar una gama de reactivos, desde microlitros hasta varios mililitros. FAST se compone de una película elástica, una palanca y un bloque. Cuando no se aplica presión neumática, la película, la palanca y el bloque se pueden sellar herméticamente y el líquido del interior se puede almacenar durante largos períodos de tiempo. Cuando se aplica la presión adecuada que se puede ajustar en función de la longitud de la palanca, la película se expande y empuja la palanca para abrirla para permitir que el líquido fluya. Esto permite la dispensación multifuncional de líquido en forma de cascada, simultánea, secuencial o selectiva.

Hemos desarrollado un sistema de PCR que utiliza FAST para obtener resultados de "muestra de entrada, respuesta de salida" para la detección del virus de la influenza A y B (IAV e IBV). Logramos un límite inferior de detección (LOD) de 102 copias/ml y nuestras pruebas multiplexadas demostraron especificidad para IAV e IBV y proporcionaron capacidad de patotipado para el virus de la influenza. Los resultados de las pruebas clínicas que utilizan la muestra de hisopo nasal de 18 pacientes y 18 individuos sanos muestran una buena concordancia en la intensidad de la fluorescencia con la RT-PCR estándar (coeficientes de Pearson > 0,9). El costo estimado del material del dispositivo FAST-POCT es de aproximadamente $1 (Tabla complementaria 1), que se puede reducir aún más cuando se utiliza el método de fabricación en masa (por ejemplo, inyección de molde). En términos prácticos, el dispositivo POCT basado en FAST tiene todas las características requeridas previstas por la OMS, es compatible con los métodos de prueba bioquímicos emergentes, como la prueba de termociclo plasmónico44, el inmunoensayo sin amplificación45 y la prueba funcionalizada con nanocuerpos46, lo que sugiere oportunidades para los sistemas POCT. .

La figura 1a ilustra la estructura de una plataforma FAST-POCT que consta de cuatro cámaras fluídicas: la cámara de almacenamiento previo, la cámara de mezcla, la cámara de reacción y la cámara de desechos. Un habilitador clave para controlar el flujo de fluidos es la estructura FAST (que consta de una película elástica, una palanca y un bloque) ubicada en las cámaras de prealmacenamiento y mezcla. Como método accionado neumáticamente, la estructura FAST permite un control preciso del flujo de fluidos, incluido el cambio entre los estados sellado y abierto, dosificación multifuncional, liberación de fluidos a pedido, operaciones sólidas (p. ej., insensibles a las vibraciones ambientales) y largo plazo. almacenamiento. La plataforma FAST-POCT consta de cuatro capas: capa de sustrato, capa de película elástica, capa de película plástica y capa de cubierta, como se ve en una vista ampliada en la figura 1b (también detallada en las figuras complementarias S1 y S2). Todos los canales y cámaras de transporte de líquidos (p. ej., cámaras de prealmacenamiento y reacción) están integrados en el sustrato de PLA (ácido poliláctico), con un espesor de 0,2 mm (parte más delgada) a 5 mm. El material de la película elástica es PDMS, con un espesor de 300 μm y se expande fácilmente cuando se aplica presión de aire debido a su "espesor delgado" y módulo elástico pequeño (alrededor de 2,25 MPa47). La capa de película plástica está hecha de tereftalato de polietileno (PET) con un espesor de 100 μm y se utiliza para proteger la película elástica de una deformación excesiva debido a la presión neumática. En correspondencia con las cámaras en la capa de sustrato, hay palancas que se conectan con la capa de cubierta (hecha de PLA) a través de bisagras para controlar el flujo de líquido. La película elástica se adhiere a la capa de sustrato mediante una cinta adhesiva de doble cara (ARseal 90880) y se cubre con la película de plástico. Se utilizan estructuras de clip en forma de T en la capa de cubierta para ensamblar las tres capas sobre el sustrato. El clip en forma de T tiene un espacio libre entre dos patas. Cuando se empuja el clip en la ranura, las dos patas se doblan ligeramente y luego recuperan su estado original a medida que atraviesa la ranura y unen firmemente la cubierta y el sustrato (Fig. S1 complementaria). Luego se usa un conector para ensamblar las cuatro capas.

un Diagrama esquemático de la plataforma con ilustración de diferentes cámaras funcionales y las características de FAST. b Diagrama esquemático de vista ampliada de la plataforma FAST-POCT. c Fotografía de la plataforma junto a una moneda de un cuarto de dólar estadounidense.

El mecanismo de trabajo de la plataforma FAST-POCT se muestra en la Fig. 2. Los componentes clave son un bloque en la capa de sustrato y una bisagra en la capa de cubierta, lo que conduce a un ajuste de interferencia cuando las cuatro capas se ensamblan a través de la T- estructuras de clip en forma. Cuando no se aplica la presión neumática (Fig. 2a), el ajuste de interferencia provoca la deformación por flexión de la bisagra, ejerciendo las fuerzas de sellado a través de la palanca para presionar la película elástica contra el bloque y sellar el líquido en la cámara, que es definido como un estado sellado. Cabe señalar que en este estado, la palanca se dobla hacia afuera, como se ve desde la vista lateral en la Fig. 2a. Cuando se aplica la presión neumática (Fig. 2b), la película elástica se expande hacia afuera hasta la capa de cobertura y empuja la palanca hacia arriba; por lo tanto, se abre un espacio entre la palanca y el bloque para permitir que el líquido fluya a la siguiente cámara, que se define como un estado abierto. Cuando se elimina la presión neumática, la palanca puede recuperar su posición original y permanecer en su estado sellado debido a la propiedad elástica de las bisagras. El video del movimiento de la palanca se proporciona en la película complementaria S1.

Diagramas esquemáticos e imágenes para un estado Sellado. Cuando no se aplica presión, las palancas presionan la película contra los bloques y el líquido se sella. b Estado abierto. Cuando se aplica presión, la película se expande y empuja la palanca hacia arriba, por lo que el canal se abre y el líquido puede fluir. c Tamaños característicos que determinan la presión crítica. Los tamaños característicos involucran la longitud de la palanca (L), la distancia entre el bloque y la bisagra (l) y el grosor de la protuberancia de la palanca (t). Fs es la fuerza de sellado en el punto de bloqueo B. q es una carga uniformemente distribuida sobre la palanca. Tx* denota el par en la bisagra generado por la palanca. Presión crítica significa la presión necesaria para empujar la palanca hacia arriba y hacer que el líquido fluya. d Los resultados teóricos y experimentales de la relación entre la presión crítica y los tamaños característicos. Se realizaron n = 6 experimentos independientes con los datos que se muestran como ± sd Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

A continuación se desarrolla un modelo analítico basado en la teoría de vigas para analizar la presión crítica Pc, a la que se abre un espacio en función de los parámetros geométricos (p. ej., L es la longitud de la palanca, l es la distancia entre el bloque y la bisagra). , S es el área de contacto de la palanca con el líquido y t es el espesor de la protuberancia de la palanca que se muestra en la Fig. 2c). Como se detalla en la Nota complementaria y la Figura complementaria S3, se abre un espacio cuando \({P}_{c}\ge \frac{2{F}_{s}l}{SL}\), donde Fs es el sellado fuerza relacionada con el ajuste de interferencia y lidera el par \({T}_{x}^{\ast }(={F}_{s}l)\) generado por la deformación por flexión de la bisagra. Las caracterizaciones experimentales y los modelos analíticos muestran una buena concordancia (Fig. 2d), lo que demuestra que la presión crítica Pc aumenta con el aumento de t/l y la disminución de L, lo que se explica fácilmente por el modelo de viga clásico, es decir, el par aumenta con t /l. Nuestro análisis teórico demuestra claramente que la presión crítica se puede ajustar de manera efectiva ajustando la longitud de la palanca L y la relación t/l, lo que proporciona una base importante para el diseño de la plataforma FAST-POCT.

La plataforma FAST-POCT permite la dispensación multifuncional (como se muestra en la Fig. 3a con ilustraciones y experimentos), que es la característica más importante para un POCT exitoso en el que el líquido se puede manipular en cualquier dirección y en cualquier orden en cascada, simultáneo, secuencial , o dosificación multifuncional selectiva. La figura 3a(i) presenta el modo de dispensación en cascada en el que dos o más cámaras se conectan en cascada utilizando los bloques para separar los diferentes reactivos y una palanca para controlar los estados abierto y cerrado. Cuando se aplica presión, el líquido fluye desde la cámara superior a la inferior en forma de cascada. Cabe señalar que las cámaras en cascada se pueden llenar con productos químicos húmedos o productos químicos secos, como polvos liofilizados. En el experimento de la Fig. 3a(i), la tinta roja de la cámara superior fluyó hacia la segunda cámara con polvos de colorante azul (sulfato de cobre) y se volvió azul oscuro cuando llegó a la cámara inferior. Aquí también se muestra la presión de control al líquido inyectado. De manera similar, cuando una palanca está conectada a dos cámaras, se convierte en el modo de inyección simultánea como se muestra en la Fig. 3a (ii) en el que el líquido puede distribuirse por igual a dos o más cámaras cuando se aplica presión. Dado que la presión crítica depende de la longitud de la palanca, se puede ajustar la longitud de la palanca para lograr un modo de inyección secuencial, como se muestra en la Fig. 3a(iii). Se conectó una palanca larga (con presión crítica Pc_larga) a la cámara B y una palanca corta (con presión crítica Pc_corta > Pc_larga) a la cámara A. Como se aplicó la presión P1 (Pc_larga < P1 < Pc_corta), solo el líquido en rojo puede fluir a la cámara B y cuando se aumentó la presión a P2 (> Pc_short), el líquido azul puede fluir a la cámara A. Este modo de inyección secuencial se aplica a diferentes líquidos que se transfieren a sus cámaras relacionadas en secuencia, lo cual es fundamental para una POCT exitosa dispositivo. La Figura 3a(iv) demuestra el modo de inyección selectiva, donde la cámara principal tenía una palanca corta (con presión crítica Pc_corta) y una larga (con presión crítica Pc_larga < Pc_corta) que estaban conectadas a la cámara A y a la cámara B, respectivamente, además a otro canal de aire conectado a la cámara B. Para transferir el líquido a la cámara A primero, se aplicaron al dispositivo la presión P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) y P2 (P2 > P1) con P1 + P2 > Pc_short al mismo tiempo. De esta manera, P2 impidió que el líquido entrara en la cámara B; mientras tanto, la presión total P1 + P2 superó la presión crítica para activar la palanca más corta conectada a la cámara A para permitir el flujo de líquido a la cámara A. Luego, cuando se requería llenar la cámara B, solo necesitamos aplicar P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) en la cámara principal para activar la palanca larga y permitir que el líquido fluya hacia la cámara B. Se puede observar claramente desde el tiempo t = 3 s hasta los 9 s que el líquido en la cámara A se mantuvo constante mientras aumentaba en la cámara B cuando se aplicó la presión P1. Cuando sea necesario volver a llenar la cámara A, solo debemos aplicar P1 en la cámara principal y P2 en la cámara adicional. De esta forma, el comportamiento del flujo puede cambiar selectivamente entre las cámaras A y B. El comportamiento del flujo de los cuatro modos de dosificación multifuncional se puede encontrar en la película complementaria S2.

a Ilustración de la dispensación multifuncional, a saber, (i) dispensación en cascada, (ii) simultánea, (iii) secuencial y (iv) selectiva. Las curvas indican el proceso de trabajo y los parámetros de estos cuatro modos de dosificación. b Los resultados de las pruebas de almacenamiento a largo plazo de agua DI y etanol. Se realizaron n = 5 experimentos independientes con los datos mostrados como ± sd c Demostración de las pruebas de robustez cuando el dispositivo FAST y el dispositivo basado en válvula capilar (CV) están en (i) estado estático y (ii) estado vibratorio. (iii) El volumen en función del tiempo para dispositivos FAST y CV bajo diferentes frecuencias de vibración angular. d Resultados de las pruebas de liberación bajo demanda de (i) dispositivo FAST y (ii) dispositivo CV. (iii) La relación entre el volumen y el tiempo para dispositivos FAST y CV que utilizan un modo de presión intermitente. Todas las barras de escala, 1 cm. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

El almacenamiento de reactivos a largo plazo es otra característica esencial para un dispositivo POCT exitoso, que permitirá que personal no capacitado manipule múltiples reactivos. Aunque muchas técnicas muestran su potencial para el almacenamiento a largo plazo (p. ej., microdispensador35, blíster48 y paquetes de barra49), se requiere una cámara de recepción especial para contener los paquetes, lo que aumenta el costo y la complejidad; además, estos mecanismos de almacenamiento no permiten la liberación bajo demanda y conducen a la pérdida de reactivos debido a los residuos en los paquetes. La capacidad de almacenamiento a largo plazo se probó mediante la realización de pruebas de vida acelerada, utilizando material PMMA fabricado con la técnica CNC debido a su pequeña rugosidad y la resistencia a la permeación de gas (Figura complementaria S5). Los dispositivos de prueba se llenaron con agua DI (agua desionizada) y etanol al 70 % (para simular los reactivos volátiles) a 65 °C durante 9 días. Tanto el agua desionizada como el etanol se almacenaron usando papel de aluminio para sellar su entrada superior. Para el cálculo del tiempo real equivalente se aplicó una ecuación de Arrhenius y la energía de activación por permeación reportada en la literatura50,51. La figura 3b muestra los resultados de la pérdida de peso promedio de cinco muestras mantenidas a 9 días a 65 °C, es decir, equivalente a 0,30 % para agua DI y 0,72 % para etanol al 70 % durante más de 2 años a 23 °C.

La Figura 3c presenta la prueba de robustez bajo vibración. Dado que la válvula capilar (CV) es la técnica de manipulación de líquidos más popular en los dispositivos POCT existentes28,29, se utiliza un dispositivo CV con un ancho de 300 μm y una profundidad de 200 μm para comparar. Se observa que cuando ambos dispositivos se mantuvieron quietos, el líquido en la plataforma FAST-POCT se selló y el líquido para el dispositivo CV se pinzó debido a la expansión brusca del canal, lo que redujo la fuerza capilar. Sin embargo, a medida que aumentaba la frecuencia vibratoria angular del agitador orbital, el líquido en la plataforma FAST-POCT permaneció sellado, pero el líquido en el dispositivo CV fluyó hacia la cámara inferior (consulte también la película complementaria S3). Esto sugiere que la bisagra deformada en la plataforma FAST-POCT puede proporcionar una fuerza mecánica robusta al bloque y, por lo tanto, sellar herméticamente el líquido en la cámara. Sin embargo, para el dispositivo CV, el líquido se fija debido al equilibrio entre las fases sólida, líquida y de aire, lo que crea inestabilidad y la posibilidad de que la vibración rompa el equilibrio y produzca un comportamiento de flujo no deseado. La ventaja de la plataforma FAST-POCT es que proporciona un funcionamiento sólido y evita fallas operativas en presencia de vibraciones, que generalmente ocurren durante la entrega y la operación.

Otra característica importante de la plataforma FAST-POCT es su rendimiento de lanzamiento bajo demanda, que es un requisito fundamental en el análisis cuantitativo. La Figura 3d compara el lanzamiento bajo demanda para la plataforma FAST-POCT y un dispositivo CV. En la Fig. 3d(iii) vemos que el dispositivo FAST tiene una respuesta rápida a la señal de presión. Cuando se aplicó la presión sobre una plataforma FAST-POCT, el líquido fluyó; el flujo se detuvo inmediatamente una vez que se eliminó la presión (Fig. 3d (i)). Esta acción se puede atribuir a la rápida recuperación elástica de la bisagra, que empuja la palanca hacia el bloque y, por lo tanto, sella la cámara. Sin embargo, en el dispositivo CV, el líquido continúa fluyendo, lo que genera un volumen de líquido no deseado de aproximadamente 100 μl al final cuando se elimina la presión (Fig. 3d (ii) y Película complementaria S4). Esto se puede atribuir a la desaparición del efecto de fijación capilar tras la humectación total del CV posterior a la primera inyección.

La capacidad de manejar líquidos con diferente humectabilidad y viscosidad en un mismo dispositivo sigue siendo un desafío para la aplicación POCT. La baja humectabilidad puede causar fugas u otro comportamiento de flujo no intencional en el canal y la preparación de líquidos de alta viscosidad a menudo requiere instrumentos auxiliares, como mezcladores de vórtice, centrífugas y filtros52. Probamos la relación entre la presión crítica y las propiedades del líquido (con un amplio rango de humectabilidad y viscosidad). Los resultados se muestran en la Tabla 1 y en la Película S5. Se puede ver que el líquido con diferente humectabilidad y viscosidad se puede sellar herméticamente en la cámara, y cuando se aplica presión, incluso el líquido con una viscosidad tan alta como 5500 cP también se puede transferir a la siguiente cámara, lo que hace que el Es posible realizar pruebas de muestras de alta viscosidad (es decir, esputo, una muestra altamente viscosa utilizada para diagnosticar enfermedades respiratorias).

Al combinar la unidad dispensadora multifuncional mencionada anteriormente, se puede desarrollar una amplia gama de dispositivos POCT basados ​​en FAST. Demostramos un ejemplo como se muestra en la Fig. 1. Esta unidad contiene cámaras de prealmacenamiento, cámara de mezcla, cámara de reacción y una cámara de desechos. Los reactivos de reacción se pueden almacenar a largo plazo en las cámaras de almacenamiento previo y luego se pueden liberar a la cámara de mezcla. Los reactivos mezclados se pueden transferir de forma selectiva a la cámara de residuos o a la cámara de reacción cuando se aplica la presión adecuada.

Dado que las pruebas de PCR son el estándar de oro para la detección de patógenos (p. ej., H1N1 y COVID-19) e implican varios pasos de reacción, utilizamos la plataforma FAST-POCT para las pruebas de PCR como aplicación. La Figura 4 muestra el procedimiento de prueba de PCR utilizando la plataforma FAST-POCT. Los reactivos de elución, los reactivos de microesferas magnéticas, la solución de lavado A y la solución de lavado W se pipetearon primero en las cámaras de prealmacenamiento E, M, W1 y W2, respectivamente. Los pasos de adsorción de ARN se muestran en la Fig. 4a y son los siguientes: (1) La muestra se pipeteó en la cámara M y se liberó en la cámara de mezcla cuando se aplicó la presión P1 (= 0,26 bar). (2) La presión de aire P2 (= 0,12 bar) se aplicó a través del canal A, que estaba conectado al fondo de la cámara de mezcla. Aunque muchas técnicas de mezcla muestran su potencial para la mezcla de líquidos en las plataformas POCT (p. ej., mezcla serpentina53, mezcla caótica54 y mezcla en modo discontinuo55), su eficiencia y eficacia de mezcla aún son insatisfactorias. Aquí, se emplea un método de mezcla de burbujas, en el que se introduce aire en el fondo de la cámara de mezcla generando burbujas de aire en el líquido; el fuerte vórtice permite un rendimiento de mezcla completo en varios segundos. Se llevaron a cabo los experimentos de mezcla de burbujas y los resultados se proporcionan en la Fig. S6 complementaria. Se puede ver que cuando se aplicó una presión de 0,10 bar, tomó alrededor de 8 s completar una mezcla completa. A medida que la presión aumentó a 0,20 bar, solo se necesitaron unos 2 s para obtener una mezcla completa. El método para calcular la eficiencia de mezcla se proporciona en la sección de métodos. (3) Se usó un imán de rubidio para extraer las microesferas, seguido de una presión P3 (= 0,17 bar) a través del canal P para transferir los reactivos a la cámara de desechos. La Figura 4b, c muestra los pasos de lavado, que se realizaron para eliminar las impurezas de la muestra, de la siguiente manera: (1) La solución de lavado A de la cámara W1 se liberó a la cámara de mezcla usando la presión P1. (2) A continuación, se realizó el proceso de mezcla de burbujas. (3) La solución de lavado A se transfirió a la cámara de desechos, con las microperlas extraídas en la cámara de mezclado por el imán. El proceso de lavado W (Fig. 4c) es similar al lavado A (Fig. 4b). Cabe señalar que cada paso de lavado A y W se realizó dos veces. La figura 4d muestra el paso de elución en el que se eluye el ARN de las microperlas; los pasos de inyección y mezcla de elución son los mismos que los de los pasos de adsorción y lavado de ARN mencionados anteriormente. Dado que el reactivo de elución se transfirió a la cámara de reacción de PCR, se aplicaron simultáneamente las presiones P3 y P4 (= 0,23 bar), lo que logró la presión crítica de la palanca para sellar la cámara de reacción de PCR. De manera similar, la presión P4 también ayuda a sellar el canal que conduce a la cámara de desechos. Por lo tanto, todos los reactivos de elución se distribuyeron por igual en las cuatro cámaras de reacción de PCR para provocar una reacción de PCR multiplex. El proceso mencionado anteriormente se proporciona en la película complementaria S6.

En un paso de adsorción de ARN, la muestra se introduce en la entrada M y se inyecta en la cámara de mezcla junto con la solución de microesferas almacenada previamente. Después de mezclar y extraer las perlas, el reactivo se distribuye en la cámara de desechos. b, c Paso de lavado, se inyectan diferentes reactivos de lavado previamente almacenados en la cámara de mezcla y, después de mezclar y extraer las perlas, los reactivos se transfieren a la cámara de desechos. d Paso de elución, se inyecta el reactivo de elución y, después de mezclar y extraer las perlas, el reactivo se transfiere a la cámara de reacción de PCR. Las curvas muestran el proceso de trabajo y los parámetros relacionados en diferentes pasos. La presión es la presión aplicada a través de varias cámaras. El volumen es el volumen del líquido en la cámara de mezcla. Todas las barras de escala son de 1 cm. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Se lleva a cabo el proceso de prueba de PCR y el perfil térmico se proporciona en la Fig. S7 complementaria, incluido el tiempo de transcripción inversa de 20 min y el tiempo de termociclado (95 y 60 ° C) de 60 min, con un termociclo de 90 s (Suplementario Película T7). FAST-POCT tarda menos tiempo en completar un termociclo (90 s) que la RT-PCR convencional (180 s para un termociclo). Esto se puede atribuir a la alta relación superficie-volumen y la pequeña inercia térmica de la cámara de reacción de PCR a microescala. La superficie de la cámara es de 96,6 mm2 y el volumen de la cámara es de 25 mm3, lo que hace que la relación superficie-volumen sea de aproximadamente 3,86. En la Figura complementaria S10 se puede ver que hay una ranura en la parte posterior del área de prueba de PCR de nuestra plataforma, lo que hace que el grosor inferior de la cámara de PCR sea de 200 μm. Se adhiere una almohadilla elástica de transferencia de calor a la superficie de calentamiento de la unidad de control de temperatura, asegurando el contacto firme con la superficie posterior de la cámara de prueba. De esta forma, se puede reducir la inercia térmica de la plataforma y se aumenta la eficiencia de calefacción/refrigeración. Durante el proceso de termociclado, la cera de parafina incrustada en la plataforma se derritió y fluyó hacia la cámara de reacción de PCR, actuando como una sustancia selladora para evitar la evaporación del reactivo y la contaminación ambiental (visto en la película complementaria S8).

Todos los procesos de prueba de PCR mencionados anteriormente se automatizaron completamente utilizando un instrumento FAST-POCT personalizado, que consta de una unidad de control de presión programada, una unidad de extracción magnética, una unidad de control de temperatura y una unidad de captura y procesamiento de señales fluorescentes. Cabe señalar que usamos la plataforma FAST-POCT para la extracción de ARN y luego usamos las muestras de ARN extraídas para ejecutar reacciones de PCR usando el sistema FAST-POCT y el sistema de PCR de sobremesa para comparar. Los resultados son casi idénticos a los que se muestran en la figura complementaria S8. El operador realiza la tarea simple de inyectar la muestra en la cámara M e insertar la plataforma en el instrumento. Los resultados de las pruebas cuantitativas están disponibles luego de aproximadamente 82 min. Puede encontrar información detallada sobre el instrumento FAST-POCT en las figuras complementarias. S9, S10 y S11.

La influenza causada por el virus de la influenza A (IAV), B (IBV), C (ICV) y D (IDV) es un fenómeno global común. Entre estos, IAV e IBV son responsables de la mayoría de los casos de enfermedades graves, así como de epidemias estacionales, que infectan entre el 5 y el 15 % de la población mundial, provocan entre 3 y 5 millones de casos de enfermedades graves y representan entre 290 000 y 650 000 muertes cada año debido a enfermedad respiratoria56,57. El diagnóstico temprano de IAV e IBV es fundamental para reducir la morbilidad y sus cargas económicas asociadas. Entre las técnicas diagnósticas disponibles, la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) se considera la más sensible, específica y precisa (>99%)58,59. Sin embargo, las técnicas convencionales de RT-PCR requieren varias operaciones de pipeteo, mezcla, medición y transferencia de líquidos, lo que limita el acceso al personal profesional en entornos con recursos limitados. Aquí, se aplicó la plataforma FAST-POCT para la prueba de PCR de IAV e IBV por separado para obtener su límite inferior de detección (LOD). Además, se realizaron pruebas multiplexadas de IAV e IBV para diferenciar diferentes patotipos de una especie, lo que proporcionó una plataforma de análisis genético prometedora y una oportunidad para el tratamiento preciso de enfermedades.

La Figura 5a muestra los resultados de las pruebas de PCR para IAV utilizando 150 μl de ARN viral purificado como muestras. La Figura 5a(i) muestra que cuando la concentración de IAV era de 106 copias/ml, la intensidad de la fluorescencia (ΔRn) puede ser de 0,830 y, a medida que la concentración se reduce a 102 copias/ml, ΔRn aún puede ser tan alto como 0,365, que es aproximadamente 100 veces mayor que la del grupo de control negativo en blanco (0,002). Para el análisis cuantitativo, se obtuvo una curva de calibración lineal entre la concentración logarítmica de IAV y el umbral del ciclo (Ct) (Fig. 5a(ii)) con R2 = 0,993 en el rango de 102–106 copias/ml en base a seis experimentos separados . Estos resultados concuerdan bien con las técnicas convencionales de RT-PCR. La Figura 5a(iii) muestra las imágenes de fluorescencia de los resultados de las pruebas después de 40 ciclos de la plataforma FAST-POCT. Descubrimos que la plataforma FAST-POCT puede detectar tan solo 102 copias/ml de IAV. Sin embargo, el método convencional no tiene un valor de Ct en la concentración de 102 copias/ml, por lo que su LOD es de unas 103 copias/ml. Suponemos que esto puede atribuirse a la alta eficiencia de la mezcla de burbujas. Los experimentos de prueba de PCR para ARN de IAV purificados se realizaron para evaluar diferentes métodos de mezcla, incluida la mezcla con agitación (el mismo método de mezcla que la operación de RT-PCR convencional), la mezcla con burbujas (el método actual, 3 s a la presión de 0,12 bar) y sin mezclar como grupo de control. Los resultados se pueden encontrar en la figura complementaria S12. Puede verse que cuando la concentración de ARN es alta (106 copias/ml), el valor Ct para diferentes métodos de mezcla es casi el mismo que el valor Ct de la mezcla con burbujas. A medida que la concentración de ARN disminuye a 102 copias/ml, el grupo de mezcla con agitación y el grupo de control no muestran ningún valor de Ct, mientras que el método de mezcla de burbujas sigue obteniendo un valor de Ct de 36,9, que está por debajo del valor umbral de Ct de 38. Los resultados muestran la ventaja de mezcla de burbujas, que también se demuestra en otra literatura60 y también puede explicar la razón por la cual la plataforma FAST-POCT tiene una sensibilidad ligeramente superior a la de la RT-PCR convencional. La Figura 5b muestra los resultados de las pruebas de PCR para muestras de ARN de IBV purificadas, con una concentración que oscila entre 101 y 106 copias/ml. Los resultados son similares a los de la prueba IAV, que logró un R2 = 0,994 y un LOD de 102 copias/ml.

a Resultados de la prueba de PCR para el virus de la influenza A (IAV) con una concentración de IAV que oscila entre 106 y 101 copias/ml utilizando el tampón TE como control negativo (NC). (i) Perfil de fluorescencia en tiempo real. (ii) La curva de calibración lineal entre la concentración logarítmica de ARN de IAV y el umbral del ciclo (Ct) para la técnica de prueba tanto FAST como convencional. (iii) Imágenes de fluorescencia de FAST-POCT con IAV después de 40 ciclos. b, resultados de las pruebas de PCR para el virus de la influenza B (IBV) con (i) perfil de fluorescencia en tiempo real. (ii) la curva de calibración lineal y (iii) imágenes de fluorescencia de FAST-POCT con IBV después de 40 ciclos. El límite inferior de detección (LOD) para IAV e IBV utilizando la plataforma FAST-POCT es de 102 copias/ml, que es inferior al de los métodos convencionales (103 copias/ml). c Múltiples resultados de detección para IAV e IBV. Se usó GAPDH para el control positivo y el tampón TE para el control negativo para evitar una posible contaminación y amplificación de fondo. Se pueden identificar cuatro tipos diferentes de muestras: (1) muestra negativa ("IAV-/IBV-") con solo GAPDH; (2) infectados por IAV ("IAV+/IBV-") con IAV y GAPDH; (3) infectados por IBV ("IAV-/IBV+") con IBV y GAPDH; (4) infectados por IAV/IBV ("IAV+/IBV+") con IAV, IBV y GAPDH. Las líneas punteadas indican la línea de umbral. Se realizaron n = 6 experimentos biológicamente independientes con los datos que se muestran como ± sd Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La Figura 5c muestra los resultados de las pruebas multiplexadas para IAV/IBV. Aquí, los lisados ​​virales se usaron como solución de muestra en lugar de los ARN purificados, con cuatro cebadores dirigidos a IAV, IBV, GAPDH (control positivo) y tampón TE (control negativo) agregados a las cuatro cámaras de reacción diferentes del FAST-POCT. plataforma. El control positivo y negativo utilizado aquí es para evitar una posible contaminación y amplificación de fondo. La prueba se clasificó en cuatro grupos: (1) muestra negativa ("IAV-/IBV-") con solo GAPDH; (2) infectados por IAV ("IAV+/IBV-") con IAV y GAPDH; (3) infectados por IBV ("IAV-/IBV+") con IBV y GAPDH; (4) infectados por IAV/IBV ("IAV+/IBV+") con IAV, IBV y GAPDH. La Figura 5c muestra que cuando se aplicó una muestra negativa, la cámara de control positivo exhibió una intensidad de fluorescencia ΔRn de 0,860 con ΔRn de IAV e IBV similar a la del control negativo (0,002). Para los grupos IAV+/IBV−, IAV−/IBV+ e IAV+/IBV+, las cámaras IAV/GAPDH, IBV/GAPDH e IAV/IBV/GAPDH presentaron una intensidad de fluorescencia significativa, respectivamente, mientras que otras cámaras mostraron intensidades de fluorescencia en el nivel de fondo incluso después de 40 termociclos. De las pruebas anteriores, la plataforma FAST-POCT muestra una especificidad destacada y nos permite patotipificar diferentes virus de influenza a la vez.

Para validar la aplicabilidad clínica de FAST-POCT, analizamos 36 muestras clínicas (muestras de hisopos nasales) de pacientes (n = 18) con IBV e individuos de control (n = 18) sin IBV (Fig. 6a). La información del paciente está disponible en la Tabla complementaria 3. El estado de infección por IBV se confirmó de forma independiente y los protocolos del estudio fueron aprobados por The First Affiliated Hospital of Zhejiang University (Hangzhou, Zhejiang). Cada muestra de pacientes se dividió en dos categorías. Una alícuota se procesó con FAST-POCT y la otra con un sistema de PCR de sobremesa (SLAN-96P, China). Ambos ensayos utilizaron los mismos kits de prueba y purificación. La Figura 6b muestra los resultados de FAST-POCT y PCR convencional con transcripción inversa (RT-PCR). Comparamos la intensidad de fluorescencia (FAST-POCT) con −log2(Ct), donde Ct es el corte del ciclo de la RT-PCR convencional. Se observó una buena concordancia entre estos dos métodos. FAST-POCT y RT-PCR mostraron una fuerte correlación positiva con los valores del coeficiente de Pearson (r) de 0,90 (Fig. 6b). A continuación, evaluamos la precisión diagnóstica de FAST-POCT. Como medidas analíticas independientes, se proporciona la distribución de la intensidad de fluorescencia (FL) para muestras positivas y negativas (Fig. 6c). Los valores de FL fueron significativamente más altos (****P = 3.31 × 10−19; prueba t bilateral) en pacientes con IBV que en los grupos de control (Fig. 6d). Las curvas de características operativas del receptor (ROC) se construyeron adicionalmente para IBV. Encontramos que la precisión diagnóstica fue excelente, con un área bajo la curva de 1 (Fig. 6e). Tenga en cuenta que debido al pedido obligatorio de máscaras en China desde 2020 debido a COVID-19, no encontramos pacientes con IAV; como resultado, todas las muestras clínicas positivas (es decir, muestras de hisopos nasales) son solo para IBV.

un diseño de estudio clínico. Se analizaron un total de 36 muestras mediante la plataforma FAST-POCT y RT-PCR convencional, incluidas 18 muestras de pacientes y 18 individuos de control sin influenza. b Evaluación de la concordancia analítica entre FAST-POCT PCR y RT-PCR convencional. Los resultados se correlacionaron positivamente (r de Pearson = 0,90). c Niveles de intensidad de fluorescencia para 18 pacientes con IBV y 18 controles. Los valores de dFL fueron significativamente más altos en los pacientes con IBV (+) que en los controles (−) (****P = 3,31 × 10−19; prueba t bilateral; n = 36). Para cada diagrama de caja, la marca negra central indica la mediana, y las líneas inferior y superior de la caja indican los percentiles 25 y 75, respectivamente. Los bigotes se extienden a los puntos de datos min-max que no se consideraron valores atípicos. e Curvas ROC. La línea punteada d indica el límite estimado a partir del análisis ROC. El AUC fue 1 para IBV. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

En este documento, demostramos un FAST, que posee las características deseadas para un POCT ideal. Las ventajas de nuestra tecnología incluyen: (1) dosificación multifuncional (en forma de cascada, simultánea, secuencial y selectiva), descarga bajo demanda (descarga rápida y proporcional a la presión aplicada) y operación robusta (sin fugas bajo la vibración de 150 rad/min); (2) almacenamiento a largo plazo (pruebas de vida acelerada de 2 años con una pérdida de peso de aproximadamente 0,3 %); (3) capacidad para manejar el líquido con una amplia gama de humectabilidad y viscosidad (viscosidad tan alta como 5500 cp); (4) rentabilidad (los costos de material estimados para el dispositivo de PCR FAST-POCT son de alrededor de $1). Al combinar las unidades dispensadoras multifuncionales, se demostró una plataforma FAST-POCT integrada y se aplicó a las pruebas de PCR de los virus de influenza A y B. El IAV y el IBV pueden detectarse in situ con 102 copias/ml de LOD, y la patotipificación en un solo paso de IAV e IBV en la plataforma FAST-POCT se logró en 82 min. Las pruebas clínicas con 36 muestras de hisopos nasales mostraron una buena concordancia en la intensidad de la fluorescencia con la RT-PCR estándar (coeficientes de Pearson > 0,9). Paralelamente a este trabajo, diversas técnicas bioquímicas emergentes (es decir, pruebas de termociclo plasmónico, inmunoensayo sin amplificación y pruebas funcionalizadas con nanocuerpos) han demostrado su potencial para POCT. Sin embargo, debido a la falta de una plataforma POCT robusta y completamente integrada, estas técnicas inevitablemente requieren procesos de pretratamiento separados (por ejemplo, extracción de ARN44, incubación45 y enjuague46), lo que hace que el presente trabajo sea complementario a estas tecnologías para lograr avances Capacidades POCT con el rendimiento deseado de "entrada-respuesta-salida". En este trabajo, aunque una bomba neumática que se utiliza para activar las válvulas FAST es de tamaño pequeño y puede integrarse en un instrumento de sobremesa (Figs. S9, S10), sigue consumiendo una energía considerable y hace ruidos. En principio, la bomba neumática se puede reemplazar por otros medios para un factor de forma más pequeño, como el uso de una fuerza electromagnética o fuerzas accionadas por los dedos. Otras mejoras pueden incluir, por ejemplo, la personalización del cartucho para ensayos bioquímicos diferentes y específicos, y la adopción de un método de detección novedoso sin necesidad del sistema de calentamiento/enfriamiento, lo que lleva a una plataforma POCT sin instrumentos para aplicaciones de PCR. Creemos que la técnica FAST propuesta representa un potencial para establecer una plataforma universal no solo para pruebas biomédicas, sino también para monitoreo ambiental, inspección de calidad de alimentos, síntesis de materiales y productos farmacéuticos, dado que la plataforma FAST proporciona un medio para manipular fluidos.

La recolección y el uso de muestras de hisopos nasales humanos fueron aprobados por el comité de ética del Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Zhejiang (IIT20220330B). Se recolectaron 36 muestras de hisopos nasales, de 16 adultos < 30 años, 7 adultos > 40 años y 19 hombres, 17 mujeres. Los datos demográficos se proporcionan en la Tabla complementaria 3. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes. Todos los participantes son personas sospechosas de influenza y se ofrecieron como voluntarios para hacerse la prueba sin compensación.

El sustrato y la cubierta de FAST estaban hechos de materiales de ácido poliláctico (PLA) y se imprimieron en 3D con una impresora 3D Ender 3 Pro (Shenzhen Creality 3D Technology Co. Ltd.). El adhesivo de doble cara se adquirió de Adhesives Research, Inc., y el modo es 90880. La película de PET de 100 μm de espesor se adquirió de McMaster-Carr. Tanto los adhesivos como las películas de PET se cortaron utilizando un cortador Silhouette Cameo 2 de Silhouette America, Inc. La película elástica se fabricó con material PDMS utilizando un método de fundición en molde. En primer lugar, se cortó un marco de PET de 200 μm de espesor mediante un sistema láser y se adhirió a una lámina de PMMA de 3 mm de espesor mediante cintas de doble cara de 100 μm de espesor. Luego, se vertió en el molde un precursor de PDMS (Sylgard 184; parte A:parte B = 10:1, Dow Corning) y se eliminó el exceso de PDMS con una varilla de vidrio. Cuando se somete a 3 h de curado a 70 °C, la película de PDMS con un espesor de 300 μm se puede despegar del molde.

Las imágenes de la dispensación multifuncional, la liberación a pedido y las operaciones sólidas se tomaron con una cámara de alta velocidad (Sony AX700 con 1000 fps). El agitador orbital utilizado en las pruebas de robustez se adquirió de SCILOGEX (SCI-O180). Se usó un compresor de aire para generar la presión de aire y se usaron varios reguladores de presión digitales de precisión para ajustar el valor de la presión. El proceso de prueba del comportamiento del flujo es el siguiente. Se inyectó una determinada cantidad de líquido en el dispositivo de prueba y se aplicó una cámara de alta velocidad para registrar el comportamiento del flujo. Luego, las imágenes fijas se capturaron del video de comportamiento de flujo en puntos de tiempo fijos y el área restante se calculó usando el software Image-Pro Plus y luego se multiplicó por la profundidad de la cámara para calcular el volumen. Los detalles sobre el sistema de prueba del comportamiento del flujo se pueden encontrar en la Fig. S4 complementaria.

Se inyectaron 50 μl de microesferas y 100 μl de agua DI en un dispositivo de mezcla de burbujas. Las imágenes del rendimiento de la mezcla se tomaron con una cámara de alta velocidad cada 0,1 s con una presión que variaba entre 0,1 bar, 0,15 bar y 0,2 bar, respectivamente. La información de píxeles durante la mezcla se puede obtener de estas imágenes utilizando un software de procesamiento de fotografías (photoshop CS6). Y la eficiencia de mezcla se puede lograr usando la siguiente ecuación53.

donde M es la eficiencia de mezcla, N es el número total de puntos de píxeles de muestra, ci y \(\bar{c}\) son la concentración normalizada y la concentración normalizada esperada. La eficiencia de mezcla varía de 0 (0 %, sin mezclar) a 1 (100 %, mezcla completa). Los resultados se muestran en la figura complementaria S6.

El kit de RT-PCR en tiempo real de IAV e IBV que incluye la muestra de ARN de IAV e IBV (número de catálogo: RR-0051-02/RR-0052-02, Liferiver, China), el tampón Tris-EDTA (tampón TE, número de catálogo: B541019, Sangon Biotech, China), el kit de purificación de ARN (número de catálogo: Z-ME-0010, Liferiver, China) y la solución GAPDH (número de catálogo: M591101, Sangon Biotech, China) para control positivo son todos comerciales. El kit de purificación de ARN incluye solución tampón de unión, lavado A, lavado W, solución de elución, microesferas magnéticas y AcrylCarrier. El kit de RT-PCR en tiempo real de IAV e IBV incluye una mezcla de prueba de PCR de fluorescencia de ácido nucleico IFVA y una enzima de RT-PCR. Se añadieron 6 μl de AcrylCarrier y 20 μl de microesferas magnéticas a los 500 μl de solución tampón de unión, que se agitó y posteriormente se obtuvo la solución de microesferas. Se añadieron 21 ml de etanol a los lavados A y W, que se agitaron, tras lo cual se obtuvieron las soluciones de lavado A y lavado W, respectivamente. Luego se agregaron 18 μl de mezcla de prueba de PCR de fluorescencia de ácido nucleico IFVA y 1 μl de enzima RT-PCR a 1 μl de solución de TE, que se agitó y centrifugó durante varios segundos, produciendo así los 20 μl de cebadores para IAV e IBV.

Se siguió el siguiente proceso de purificación de ARN: (1) adsorción de ARN. Se pipetearon 526 μl de solución de microesferas en un tubo de centrífuga de 1,5 ml, al que se añadió una muestra de 150 μl; A continuación, el tubo se agitó manualmente hacia arriba y hacia abajo 10 veces. La mezcla de 676 μl se transfirió a la columna de afinidad donde se centrifugó durante 60 s con una velocidad de rotación de 1,88 × 104 g. A continuación, se abandonó la solución residual posterior. (2) Paso uno de lavado. Se añadieron 500 μl de solución de lavado A a la columna de afinidad; se centrifugó durante 40 s con una velocidad de rotación de 1,88 × 104 g, y posteriormente se abandonó la solución de desecho. Este proceso de lavado se repitió dos veces. (3) Paso dos de lavado. Se añadieron 500 μl de solución de lavado W a la columna de afinidad, seguido de centrifugación durante 15 s con una velocidad de rotación de 1,88 × 104 gy luego abandono de la solución de desecho posteriormente. Este proceso de lavado se repitió dos veces. (4) Elución. Se añadieron 200 μl de solución de elución a la columna de afinidad, seguido de centrifugación durante 2 min con una velocidad de rotación de 1,88 × 104 g. (5) RT-PCR: la solución de elución se introdujo en 20 μl de solución de cebador en el tubo de PCR; Luego, el tubo se colocó en un equipo de prueba de PCR en tiempo real (SLAN-96P) para realizar el proceso de RT-PCR. Todo el proceso de prueba tomó aproximadamente 140 minutos (la purificación de ARN fue de 20 minutos y la prueba de PCR fue de 120 minutos).

Se agregaron previamente 526 μl de solución de microesferas, 1000 μl de solución de lavado A, 1000 μl de solución de lavado W, 200 μl de solución de elución y 20 μl de soluciones de cebador y se almacenaron en las cámaras M, W1, W2, E y la cámara de prueba de PCR después de la se ensambla la plataforma. Luego, la muestra de 150 μl se pipeteó en la cámara M y la plataforma FAST-POCT se insertó en el instrumento de prueba que se muestra en la figura complementaria S9. Después de aproximadamente 82 min, se obtuvieron los resultados de la prueba.

Todos los resultados de las pruebas se presentan como medias ± sd después de repetir al menos seis veces usando plataformas FAST-POCT separadas con muestras biológicamente independientes, a menos que se especifique lo contrario. No se excluyeron datos de los análisis. Los experimentos no fueron aleatorios. El investigador no estaba cegado a la asignación de grupos durante el experimento.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en Información complementaria. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Descargar referencias

CL y HJ agradecen el apoyo de Vantronics LLC, el Dr. Jun Fan del Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Zhejiang (Hangzhou, Zhejiang) por la recolección de muestras y la verificación independiente. Parte del trabajo experimental se llevó a cabo utilizando las instalaciones de la Universidad Estatal de Arizona cuando CL y HJ estaban en esa institución. HJ reconoce el apoyo de la Universidad de Westlake.

Escuela de Ingeniería, Universidad de Westlake, Hangzhou, 310024, China

Chao Liang y Hanqing Jiang

Vantronics Hangzhou Intelligence Technology Ltd., Hangzhou, 311100, China

zihang yang

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CL y HJ diseñaron los experimentos. CL y ZY llevaron a cabo experimentos y análisis. CL y HJ realizaron análisis teóricos y escribieron el artículo.

Correspondencia a Hanqing Jiang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Liang, C., Yang, Z. y Jiang, H. Una tecnología de interruptor accionado por palanca de película para la manipulación robusta, multifuncional y bajo demanda de líquidos. Nat Comun 13, 4902 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32676-4

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Recibido: 13 diciembre 2021

Aceptado: 11 de agosto de 2022

Publicado: 20 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32676-4

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